清朝光绪年间，涞阳城的百姓在平静的生活中，迎来了一场令人震惊的风波。城东民妇洪月娥，一个年轻守寡的女子，被发现悬梁自尽于城外小山上的奶奶庙。她的尸体是由最早进香的百姓发现的，地保接到消息赶来，认出是洪月娥后，匆忙前往县衙报案。
涞阳知县于揖舟，是个清正廉洁、爱民如子的好官，且断案如神，任何蹊跷的案子到他手中，都能真相大白。接到报案后，他立刻带领仵作和衙役赶到现场。洪月娥的尸身被解下时，衣衫不整，长发散乱，那美丽的双眸仿佛仍含着无尽冤屈，直勾勾地望着前方。于知县在她衣袖中找到一幅绢帕，上面歪歪扭扭地写着一行血字：“恶人金玉玄凌辱我身，惟一死以示清白。”查看洪月娥的手指，有一处伤口，血珠早已凝固，初步判断这是她咬破手指写下的血书。于知县询问众人，得知金玉玄与洪月娥同属城东，是地保管辖之人。仵作验尸完毕，确认死者生前遭人强暴，是自杀身亡，并无他杀痕迹。
于知县当即传令缉拿金玉玄，同时找来几个他们的邻居一同到堂。回到县衙，金玉玄很快被缉捕归案。于知县先将他押入后堂，向邻居们了解情况。洪月娥是个年轻寡妇，父亲是教书先生，她也粗通文墨。三年前，她嫁给自幼父母双亡的孙甜儿，夫妻感情深厚。然而去年春天，孙甜儿去深山刨药材时不幸坠崖身亡，洪月娥便孤身一人生活。金玉玄与孙甜儿是邻居，也是个孤儿，靠舅父资助读书，去年刚考中秀才，正在家中用功备考。众人都说两人品行端正，还有人想撮合他们。
于知县提审金玉玄，将血书之事告知他。金玉玄先是面露凄苦，随后大呼冤枉，称自己自幼苦读孔孟，绝不可能做出苟且之事。于知县认为血书是洪月娥亲手所写，她与金玉玄无冤无仇，没理由诬陷他，怀疑是金玉玄垂涎美色，强暴了洪月娥。于知县一拍惊堂木，要对他用刑，但金玉玄坚称自己无罪。于知县沉思片刻，询问金玉玄是否发现有人对洪月娥有不轨之心。金玉玄回忆起一个星斗寥落的午夜，他读书累了到院中散步，看到一个黑影潜入洪月娥家，隔窗偷看。他拿了棍棒过去，一棒打在那人肩上，发现是本村的恶绅王三幺。
于知县退堂后，又向地保和乡邻询问王三幺的为人。起初大家都不敢说，在于知县的鼓励下，众人纷纷道出王三幺的种种恶行，他阴险歹毒，欺男霸女。于知县反复斟酌案情，觉得金玉玄作案的可能性不大，毕竟有人在撮合他们，此时施暴不合情理，而王三幺的嫌疑很大。他看着血书，突然发现“金玉玄”三字似乎是由“王三幺”改动而成。他请来书吏核对笔迹，书吏表示大体相同，但细微处难以分辨。于知县更加确定了自己的猜测，立即派人缉拿王三幺，随后亲自前往奶奶庙。
公堂之上，王三幺跪在地上，一脸横肉，眼神中透着惶恐不安。于知县厉声喝问他是否知道自己的罪行，王三幺佯装不知。于知县拿出血书，指出上面写着他的名字。王三幺抬头一看，笑着说上面写的是“金玉玄”，不是自己。于知县大笑，向众人解释“王三幺”三字是如何改成“金玉玄”的，众人一片哗然。王三幺仍狡辩，称这只是巧合，不能以此断定他是案犯。于知县微微一笑，说要让他心服口服，随后带着王三幺前往奶奶庙。
一进庙门，王三幺便浑身打颤。于知县将他推到香案前，问他是否看到香案尘土上的字迹，隐约能看到“...王三幺…”。于知县称洪月娥的血书是铺在这香案上写的，字痕留在了尘土上，质问王三幺为何只改血书，不改香案上的字迹。王三幺瞬间瘫倒在地。于知县怒目圆睁，王三幺见证据确凿，终于招供。
原来，王三幺早就垂涎洪月娥的美貌。之前被金玉玄打了一棒后仍不死心。一天晚上，趁金玉玄外出，他用“迷魂香”迷晕洪月娥，入室行奸。洪月娥醒来后羞愤欲绝，连夜跑到奶奶庙，向观音菩萨哭诉遭遇，咬破手指写下血书后悬梁自尽。王三幺一直尾随其后，看到血书后，因害怕报复，心生毒计，将“王三幺”改成“金玉玄”，想嫁祸给金玉玄。
王三幺在供书上画押后，于知县长笑一声，告诉他那香案上的尘土是自己后来撒的，字也是自己写的，只是用计诈他，没想到他这么容易就露出马脚。至此，这起血书奇案真相大白，王三幺得到了应有的惩罚。